Despues de una breve leccion de Bestia, Spider-Man interrumpe un robo en BioTech, plantando un rastreador en la motocicleta del lider. El rastreador lo lleva a un almacen, donde interroga a un maton que le dice a donde ir despus. Despues de una batalla con Shocker, se dirige a la pista de aterrizaje, pero es interrumpido por una amenaza de bomba en el camino. En el campo de aviacion, Spider-Man observa un piloto de aviación inconsciente siendo puesto en marcha, y planta otro tiralíneas en un helicóptero utilizado por los atacantes. Con exito libera a los pilotos antes de que el aviacion se estrelle, sigue el tirania del helicóptero a una estación de tren, donde pelea contra Hombre de Arena, y sube a un tren que huye. A bordo, se encuentra con Escarabajo, que deja tras de sui­ una pista en cuanto a su regimen.

Mientras tanto, la bóveda de Science Industries es asaltada por Hammerhead y Scorpia, que han venido a tomar como rehenes a la Dra. Watts. Cuando Spider-Man los derrota, se hace evidente que Hombre de Arena ha escapado con Watts. Spider-Man decide ir a BioTech él mismo, donde en última instancia, se enfrenta a Lagarto. El derrotado Lagarto vuelve a su forma humana y explica que el objetivo de Electro era robar el dispositivo "Bio-Nexo", antes de instruir a Spider-Man a ir al laboratorio de la doctora Watts.

Tras una persecución sobre las azoteas, llega al laboratorio y se entera de la fuente de alimentación del dispositivo, sólo para ser atrapado en otra batalla contra el Hombre de Arena. Derrotando al Hombre de Arena al succionarlo por la rejilla de la alcantarilla con agua, ve un reportaje sobre la fuente de energía - un zafiro llamado Lágrima de Zeus - que se exhibe en el museo, y rápidamente se dirige allí. Encontrando a la Dra. Watts y Electro, él combate a Electro, en la batalla, la Dra. Watts es capturada accidentalmente por Electro, que ofrece liberarla si Spider-Man le da la Lágrima de Zeus. Spider-Man obedece a regañadientes, y se pierde en un intento de recuperar la joya antes de Electro la atrapa.
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TRAJES:
Al completar ciertos objetivos en el juego, nuevos trajes pueden ser desbloqueados para que Spider-Man los use. Muchos de ellos tienen poderes especiales que alteran la experiencia de juego. Se incluyen todos los trajes del primer juego con las mismas capacidades, así como varios trajes nuevos. Además de los trajes, el jugador también puede acceder a un establecimiento llamado "Create-a-Spider", lo que permite al jugador aplicar hasta tres poderes en el juego a cualquier traje. Los poderes incluyen invencibilidad, sigilo, y redes ilimitadas entre otros.
Lista de Trajes

Spider-Man
Spider-Phoenix
Prodigy
Dusk
Insulated Suit
Alex Ross - Red
Alex Ross - White
Venom 2 - Earth X
Negative Zone
Symbiote Spider-Man
Spider-Man 2099
Captain Universe
Spidey Unlimited
Amazing Bag Man
Scarlet Spidey
Ben Reilly
Quick Change Spidey
Peter Parker
Battle Damaged